开篇基于先前研究结论：乙烯响应因子（ERF.D2）与钙依赖性蛋白激酶（CPK27）存在潜在互作关系，CPK27可介导ABA信号传导促进番茄耐旱性。进一步探索ERF.D2是否可调节番茄耐旱性？

构建ERF.D2缺失（erf. d2）和过表达（OE-ERF.D2）株系并以野生型（WT）为对照，在干旱条件下观测损伤指数、离体叶片失水率、细胞膜完整性、ABA处理下叶片气孔关闭敏感性，发现相比于WT，erf. d2表现出更好的耐旱性，而OE-ERF.D2的耐旱性较低。亚细胞定位发现，ERF.D2在细胞核中发挥作用，是关键的转录因子。整体结果表明：ERF.D2负调节番茄耐旱性。

酵母双杂交实验表明：ERF.D2与CPK27有潜在结合作用。通过Y2H、pull-down、LCI、免疫共沉淀（co-IP）实验证实，无论体内外ERF.D2均可直接与CPK27相互作用，且ABA处理可使CPK27-ERF.D2互作强度提高2-3倍。蛋白稳定分析表明，在CPK27突变体蛋白提取物中ERF.D2相对丰度更高，而在烟草中过表达CPK27可降低ERF.D2-GFP蛋白水平，蛋白酶体抑制剂MG132能阻断这一过程，表明CPK27潜在通过泛素-蛋白酶体促进ERF.D2降解。

研究表明CPK27具有蛋白激酶功能，其是否直接磷酸化ERF.D2以发挥调控作用？免疫沉淀和Phos-tag免疫印迹表明，CPK27可使ERF.D2蛋白磷酸化，ABA可进一步提高ERF.D2的磷酸化水平。体外磷酸化位点检测发现ERF.D2中的两个丝氨酸残基Ser-47和Ser-52位点被磷酸化。磷酸化位点缺失突变表明Ser-52是被CPK27磷酸化的主要位点且该位点缺失后可增强ERF.D2蛋白的稳定性。整体结果表明，CPK27直接磷酸化ERF.D2以促进其降解。

为再次寻找与ERF.D2降解有关的蛋白质，收集用ABA和MG132处理的OE-ERF.D2植物叶片进行免疫沉淀-质谱（IP-MS）实验，筛选出U-box E3连接酶蛋白PUB22可介导蛋白质泛素化，当PUB22缺失时（pub22），叶片具有干旱敏感特征。蛋白质互作结果表明，ERF.D2以ABA依赖的方式与PUB22蛋白直接互作。

因PUB22具备泛素化功能，接下来聚焦ERF.D2是否被PUB22泛素化？体外实验表明，只有在E1、E2、HA标记的泛素（Ubi）和PUB22同时存在的情况下才能观察到MBP-ERF.D2的泛素化形式。烟草瞬时共表达证实PUB22可显著提高ERF.D2泛素化水平，ABA可进一步加强该过程。同时，PUB22介导的ERF.D2泛素化被CPK27的表达增强，暗示ERF.D2的磷酸化和泛素化之间具有调控关系。

利用磷酸化模拟突变体（ERF.D2 S52D）和磷酸化缺陷突变体（ERF.D2 S52A）探索蛋白翻译后修饰的级联调控关系，发现相比于WT，ERF.D2 S52D存在更高的泛素化水平，而ERF.D2 S52A的泛素化几乎完全被抑制，证实CPK27介导的Ser-52磷酸化是PUB识别并泛素化ERF.D2的前提。

为阐明ERF.D2介导的番茄耐旱性机制，使用干旱和正常条件处理7天后的ERF.D2缺失突变体（erf.d2）和WT番茄植株进行转录组测序。差异基因主要与“茉莉酸生物合成过程、代谢过程、响应过程”有关。差异基因中，丙二烯氧化物环化酶（AOC）和12氧代植物二烯酸还原酶3（OPR3）表达水平在erf.d2样本中显著升高，暗示上述两种基因在干旱响应过程中具备主导作用。同时，erf.d2中茉莉酸（JA）的含量也显著高于WT。表明，ERF.D2可抑制AOC、OPR3转录负向调控JA生物合成，进而降低番茄耐旱性。

随后，探索ERF.D2是否可直接靶向AOC或OPR3的启动子区域发挥调控作用？ EMSA、ChIP-qPCR、酵母单杂交试验（Y1H）、双荧光素酶报告实验表明ERF. D2可直接与AOC和OPR3的启动子结合，结合过程随干旱胁迫而减弱。利用RoseTTAFoldNA预测蛋白质-核酸结构，发现ERF.D2与AOC启动子的P1和OPR3启动子的GCC基序通过氢键发挥结合作用，作为AOC和OPR3的转录抑制因子。在erf.d2突变体和OE-ERF.D2植株中沉默AOC和OPR3的表达，发现erf.d2突变体的JA含量和耐旱性均显著降低，而对OE-ERF.D2的JA含量无影响。再次证实ERF.D2通过抑制AOC和OPR3的表达降低JA积累，负调控番茄耐旱性。

结合上述研究：ABA诱导ERF.D2降解，ERF.D2抑制JA合成。作者进一步推测ERF.D2在协调ABA和JA信号转导以调节番茄耐旱性中具有关键作用。对OE-ERF.D2外源施加ABA，发现ABA处理不能缓解OE-ERF.D2株系的干旱敏感性。在erf.d2突变体背景下沉默ABA相关基因，发现ABA相关基因沉默后与erf.d2突变体植物具有相似耐旱性，表明ERF.D2在ABA信号转导途径的下游起调控作用以负调控植物耐旱性。同时，cpk27 erf.d2和pub22 erf.d2双突变体比cpk27和pub22单突变体表现出更强的耐旱性。干旱胁迫下，cpk27和pub22突变体中降低的AOC、OPR和JA含量通过ERF.D2缺失突变而得到挽救。综上，ERF.D2在ABA调节的CPK27和PUB22的下游起作用以调节番茄干旱响应中的JA生物合成。

该研究首次发现乙烯响应因子ERF.D2是番茄耐旱性的负调控因子。具体机制为：正常条件下，ERF.D2通过结合茉莉酸（JA）合成关键基因AOC和OPR3的启动子，抑制其转录，降低内源JA含量，从而维持植物生长。干旱胁迫时，脱落酸（ABA）激活CPK27，CPK27磷酸化ERF.D2，促使其被PUB22泛素化降解，解除对JA合成的抑制，进而增强植株耐旱性。同时，该研究也证实了“磷酸化-泛素化”级联修饰对ERF.D2的精准调控。CPK27介导的Ser-52磷酸化时ERF.D2被PUB22识别并泛素化的前提，该过程依赖ABA信号，且通过26S蛋白酶体途径实现蛋白降解，展示了翻译后修饰在植物响应逆境中的高效性和特异性。

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